1963年，R.B.Merrifield［1］創(chuàng)立了將氨基酸的C末端固定在不溶性樹(shù)脂上，然后在此樹(shù)脂上依次縮合氨基酸，延長(zhǎng)肽鏈、合成蛋白質(zhì)的固相合成法，在固相法中，每步反應(yīng)后只需簡(jiǎn)單地洗滌樹(shù)脂，便可達(dá)到純化目的.克服了經(jīng)典液相合成法中的每一步產(chǎn)物都需純化的困難，為自動(dòng)化合成肽奠定了基礎(chǔ).為此，Merrifield獲得1984年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng).

今天，固相法得到了很大發(fā)展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又發(fā)展了Fmoc固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以這兩種方法為基礎(chǔ)的各種肽自動(dòng)合成儀也相繼出現(xiàn)和發(fā)展，并仍在不斷得到改造和完善.

Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脫除的Boc為α-氨基保護(hù)基，側(cè)鏈保護(hù)采用芐醇類.合成時(shí)將一個(gè)Boc－氨基酸衍生物共價(jià)交聯(lián)到樹(shù)脂上，用TFA脫除Boc，用三乙胺中和游離的氨基末端，然后通過(guò)Dcc活化、耦聯(lián)下一個(gè)氨基酸，最終脫保護(hù)多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了許多生物大分子，如活性酶、生長(zhǎng)因子、人工蛋白等.

多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)。它是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物,由多種氨基酸按照一定的排列順序通過(guò)肽鍵結(jié)合而成。到現(xiàn)在，人們已發(fā)現(xiàn)和分離出一百多種存在于人體的肽，對(duì)于多肽的研究和利用，出現(xiàn)了一個(gè)空前的繁榮景象。多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)多肽全合成可以驗(yàn)證一個(gè)新的多肽的結(jié)構(gòu)；設(shè)計(jì)新的多肽，用于研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；為多肽生物合成反應(yīng)機(jī)制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽藥物等。 

多肽的化學(xué)合成技術(shù)無(wú)論是液相法還是固相法都已成熟。近幾十年來(lái)，固相法合成多肽更以其省時(shí)、省力、省料、便于計(jì)算機(jī)控制、便于普及推廣的突出優(yōu)勢(shì)而成為肽合成的常規(guī)方法并擴(kuò)展到核苷酸合成等其它有機(jī)物領(lǐng)域。本文概述了固相合成的基本原理、實(shí)驗(yàn)過(guò)程，對(duì)其現(xiàn)狀進(jìn)行分析并展望了今后的發(fā)展趨勢(shì)。

從1963年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來(lái)，經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個(gè)常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。其基本原理是：先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)同一個(gè)不溶性的高分子樹(shù)脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過(guò)脫去氨基保護(hù)基并同過(guò)量的活化羧基組分反應(yīng)，接長(zhǎng)肽鏈。重復(fù)（縮合→洗滌→去保護(hù)→中和及洗滌→下一輪縮合）操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長(zhǎng)度，最后將肽鏈從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，經(jīng)過(guò)純化等處理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保護(hù)的稱為BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保護(hù)的稱為FMOC固相合成法， 

2．固相合成的基本原理 

多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過(guò)程，固相合成順序一般從C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。過(guò)去的多肽合成是在溶液中進(jìn)行的稱為液相合成法?，F(xiàn)在多采用固相合成法，從而大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。為了防止副反應(yīng)的發(fā)生，參加反應(yīng)的氨基酸的側(cè)鏈都是保護(hù)的。羧基端是游離的，并且在反應(yīng)之前必須活化?；瘜W(xué)合成方法有兩種，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)在大多采用Fmoc法合成，如圖：

具體合成由下列幾個(gè)循環(huán)組成：

一、去保護(hù)：Fmoc保護(hù)的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（piperidine）去除氨基的保護(hù)基團(tuán)。

二、激活和交聯(lián)：下一個(gè)氨基酸的羧基被一種活化劑所活化?；罨膯误w與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成。循環(huán)：這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。

三、洗脫和脫保護(hù)：多肽從柱上洗脫下來(lái)，其保護(hù)基團(tuán)被一種脫保護(hù)劑（TFA）洗脫和脫保護(hù)。

2.1 樹(shù)脂的選擇及氨基酸的固定 

將固相合成與其他技術(shù)分開(kāi)來(lái)的最主要的特征是固相載體，能用于多肽合成的固相載體必須滿足如下要求：必須包含反應(yīng)位點(diǎn)（或反應(yīng)基團(tuán)），以使肽鏈連在這些位點(diǎn)上，并在以后除去；必須對(duì)合成過(guò)程中的物理和化學(xué)條件穩(wěn)定；載體必須允許在不斷增長(zhǎng)的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻礙的接觸；另外，載體必須允許提供足夠的連接點(diǎn)，以使每單位體積的載體給出有用產(chǎn)量的肽，并且必須盡量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子載體主要有三類：聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹(shù)脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇類樹(shù)脂及衍生物，這些樹(shù)脂只有導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)，才能直接連上（第一個(gè)）氨基酸。根據(jù)所導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)的不同，又把這些樹(shù)脂及樹(shù)脂衍生物分為氯甲基樹(shù)脂、羧基樹(shù)脂、氨基樹(shù)脂或酰肼型樹(shù)脂。BOC合成法通常選擇氯甲基樹(shù)脂，如Merrifield樹(shù)脂；FMOC合成法通常選擇羧基樹(shù)脂如王氏樹(shù)脂。氨基酸的固定主要是通過(guò)保護(hù)氨基酸的羧基同樹(shù)脂的反應(yīng)基團(tuán)之間形成的共價(jià)鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)的，形成共價(jià)鍵的方法有多種：氯甲基樹(shù)脂，通常先制得保護(hù)氨基酸的四甲銨鹽或鈉鹽、鉀鹽、銫鹽，然后在適當(dāng)溫度下，直接同樹(shù)脂反應(yīng)或在合適的有機(jī)溶劑如二氧六環(huán)、DMF或DMSO中反應(yīng)；羧基樹(shù)脂，則通常加入適當(dāng)?shù)目s合劑如DCC或羧基二咪唑，使被保護(hù)氨基酸與樹(shù)脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基樹(shù)脂或酰肼型樹(shù)脂，卻是加入適當(dāng)?shù)目s合劑如DCC后，通過(guò)保護(hù)氨基酸與樹(shù)脂之間形成的酰胺鍵來(lái)完成氨基酸的固定。

氨基、羧基、側(cè)鏈的保護(hù)及脫除 

要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對(duì)暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護(hù)，同時(shí)對(duì)氨基酸側(cè)鏈上的活性基因也要保護(hù)，反應(yīng)完成后再將保護(hù)基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多采用烷氧羰基類型作為α氨基的保護(hù)基，因?yàn)檫@樣不易發(fā)生消旋。最早是用芐氧羰基，由于它需要較強(qiáng)的酸解條件才能脫除，所以后來(lái)改為叔丁氧羰基（BOC）保護(hù)，用TFA（三氟乙酸）脫保護(hù)，但不適用含有色氨酸等對(duì)酸不穩(wěn)定的肽類的合成。1978年，chang Meienlofer和Atherton等人采用Carpino報(bào)道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作為α氨基保護(hù)基，F(xiàn)moc基對(duì)酸很穩(wěn)定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去，近年來(lái)，F(xiàn)moc合成法得到了廣泛的應(yīng)用。羧基通常用形成酯基的方法進(jìn)行保護(hù)。甲酯和乙酯是逐步合成中保護(hù)羧基的常用方法，可通過(guò)皂化除去或轉(zhuǎn)變?yōu)殡乱员阌糜谄瑪嘟M合；叔丁酯在酸性條件下除去；芐酯常用催化氫化除去。對(duì)于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側(cè)鏈功能基的氨基酸的肽來(lái)說(shuō)，為了避免由于側(cè)鏈功能團(tuán)所帶來(lái)的副反應(yīng)，一般也需要用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基將側(cè)鏈基團(tuán)暫時(shí)保護(hù)起來(lái)。保護(hù)基的選擇既要保證側(cè)鏈基團(tuán)不參與形成酰胺的反應(yīng)，又要保證在肽合成過(guò)程中不受破壞，同時(shí)又要保證在最后肽鏈裂解時(shí)能被除去。如用三苯甲基保護(hù)半胱氨酸的S-，用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪唑環(huán)用2,2,2-三氟-1-芐氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保護(hù)，可通過(guò)催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基（Adoc）保護(hù)，用冷的三氟乙酸脫去。

固相中的接肽反應(yīng)原理與液相中的基本一致，將兩個(gè)相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及羧基被保護(hù)的氨基酸放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強(qiáng)的失去劑（如碳二亞氨）形成對(duì)稱酸酐等方法來(lái)形成酰胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對(duì)稱酸酐法、活化酯法接肽應(yīng)用最廣。 

裂解及合成肽鏈的純化BOC法用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基，F(xiàn)MOC法直接用TFA，有時(shí)根據(jù)條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也被采用。合成肽鏈進(jìn)一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等。 

4．固相合成的特點(diǎn)及存在的主要問(wèn)題 

固相合成法對(duì)于肽合成的顯著的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化并加速了多步驟的合成；因反應(yīng)在一簡(jiǎn)單反應(yīng)器皿中便可進(jìn)行，可避免因手工操作和物料重復(fù)轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的損失；固相載體共價(jià)相聯(lián)的肽鏈處于適宜的物理狀態(tài)，可通過(guò)快速的抽濾、洗滌未完成中間的純化，避免了液相肽合成中冗長(zhǎng)的重結(jié)晶或分柱步驟，可避免中間體分離純化時(shí)大量的損失；使用過(guò)量反應(yīng)物，迫使個(gè)別反應(yīng)完全，以便最終產(chǎn)物得到高產(chǎn)率；增加溶劑化，減少中間的產(chǎn)物聚焦；固相載體上肽鏈和輕度交聯(lián)的聚合鏈緊密相混，彼此產(chǎn)生一種相互的溶劑效應(yīng)，這對(duì)肽自聚集熱力學(xué)不利而對(duì)反應(yīng)適宜。固相合成的主要存在問(wèn)題是固相載體上中間體雜肽無(wú)法分離，這樣造成最終產(chǎn)物的純度不如液相合成物，必需通過(guò)可靠的分離手段純化。

5．固相合成的研究發(fā)展前景

固相多肽合成已經(jīng)有40年的歷史了，然而到現(xiàn)在，人們還只能合成一些較短的肽鏈，更談不上隨心所欲地合成蛋白質(zhì)了，同時(shí)合成中的試劑毒性，昂貴費(fèi)用，副產(chǎn)物等一直都是令人頭痛的問(wèn)題，而在生物體內(nèi)，核糖體上合成肽鏈的速度和產(chǎn)率都是驚人的，那么，是否能從生物體合成蛋白質(zhì)的原理上得到一些啟發(fā)，應(yīng)用在固相多肽合成（樹(shù)脂）上，這是一個(gè)令人感興趣的問(wèn)題，也許是今后多肽合成的發(fā)展。

在Boc合成法中，反復(fù)地用酸來(lái)脫保護(hù)，這種處理帶來(lái)了一些問(wèn)題：如在肽與樹(shù)脂的接頭處，當(dāng)每次用50%TFA脫Boc基時(shí)，有約1.4%的肽從樹(shù)脂上脫落，合成的肽越大，這樣的丟失越嚴(yán)重；此外，酸催化會(huì)引起側(cè)鏈的一些副反應(yīng).Boc合成法尤其不適于合成含有色氨酸等對(duì)酸不穩(wěn)定的肽類.1978年，Chang、Meienlofer和Atherton等人采用Carpino［3］報(bào)道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)基團(tuán)作為α-氨基保護(hù)基，成功地進(jìn)行了多肽的Fmoc固相合成.Fmoc法與Boc法的根本區(qū)別在于采用了堿可脫除的Fmoc為α-氨基的保護(hù)基.側(cè)鏈的保護(hù)采用TFA可脫除的叔丁氧基等，樹(shù)脂采用90%TFA可切除的對(duì)烷氧芐醇型樹(shù)脂和1%TFA可切除的二烷氧芐醇型樹(shù)脂，最終的脫保護(hù)避免了強(qiáng)酸處理.

6. HPLC分析和純化

分析HPLC使用柱子和泵系統(tǒng)，可以經(jīng)受傳遞高壓，這樣可以用極細(xì)的微粒（3-10μ m）做填料。由此多肽要在幾分鐘內(nèi)高度被分析。

HPLC分兩類：離子交換和反相。 離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現(xiàn)出相反電荷。分離是一種電荷相互作用，通過(guò)可變PH， 離子強(qiáng)度， 或兩者洗脫出多肽，通常，先用低離子強(qiáng)度的溶液，以后逐漸加強(qiáng)或一步一步加強(qiáng)，直到多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個(gè)例子使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過(guò)酸性PH中帶正電來(lái)分離。

反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過(guò)疏水作用連到柱上，用降低離子強(qiáng)度洗脫，如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價(jià)吸附到硅上的碳?xì)渫殒湗?gòu)成，這種鏈長(zhǎng)度為G4-G8碳原子。由于洗脫是一種疏水作用。大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。 然而，總體實(shí)踐中， 這兩類柱互變無(wú)多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構(gòu)成， 比如苯基。

典型的操作常由兩綬沖劑組成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見(jiàn)分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用徑向填柱，那么大小是8×100（3-10μ m）和25×250mm(10μ m)

大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸，稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸鈉/氨，TFA/TEA，磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意一點(diǎn)：硅反相柱料不能長(zhǎng)時(shí)間暴露于高pH，甚至微堿pH，因?yàn)檫@樣會(huì)破壞柱子。

7. Fmoc―氨基酸的制備和側(cè)鏈保護(hù)

Fmoc基團(tuán)是在有NaHCO3或Na2CO3存在的二氧六環(huán)溶液中，通過(guò)以下反應(yīng)引入到氨基酸中的：

理想的Fmoc-氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基應(yīng)在堿性條件下穩(wěn)定，在酸性條件下脫除.下面對(duì)其做一介紹.

7.1 Asp和Glu

Asp和Glu側(cè)鏈羧基常用t-Bu保護(hù).可用TFA、TMSBr等脫除.但是用t-Bu保護(hù)仍有側(cè)鏈環(huán)化形成酰亞胺的副反應(yīng)發(fā)生.近年來(lái)，發(fā)展了一些新的保護(hù)基如環(huán)烷醇酯、金剛烷醇酯等可減輕這一副反應(yīng)，這些保護(hù)基可用TMSOTf(三氟甲磺酸三甲硅烷酯)除去.

7.2 Ser、Thr和Tyr

ser、Thr的羥基及Tyr的酚羥基通常用t-Bu保護(hù).叔丁基的引入比較麻煩，首先ser制成芐氧羰基酯，再在酸催化下與異丁烯反應(yīng).Ser和Thr還可用芐基保護(hù)，Ser用芐醇引入芐基、Thr用溴芐引入芐基.

7.3 Asn和Gln

Asn和Gln側(cè)鏈的酰胺鍵在肽合成中一般不加以保護(hù).但合成大肽時(shí)，Asn和Gln的α-羧基活化時(shí)可能會(huì)發(fā)生分子內(nèi)脫氫反應(yīng)生成氰基化合物.堿性時(shí)Gln的側(cè)鏈可以環(huán)化生成酰胺.而且不保護(hù)的Fmoc-Gln和Fmoc-Asn在DCM中溶解度很差.為了避免這些問(wèn)題，可以用9-咕噸基，2，4，6-三甲氧芐基，4，4′―二甲氧二苯甲基或三苯甲基等保護(hù)，這四種基因均可用TFA脫除.

7.4 His

His是最容易發(fā)生消旋化的氨基酸，必須加以保護(hù).

對(duì)咪唑環(huán)的非π-N開(kāi)始用芐基(Bzl)和甲基磺?；?TOS)保護(hù).但這兩種保護(hù)基均不太理想.TOS對(duì)親核試劑不穩(wěn)定，Bzl需要用氫解或Na/NHs除去，并且產(chǎn)生很大程度消旋.Boc基團(tuán)是一個(gè)較理想的保護(hù)基，降低了咪唑環(huán)的堿性，抑制了消旋，成功地進(jìn)行了一些合成.但是當(dāng)反復(fù)地用堿處理時(shí)，也表現(xiàn)出一定的不穩(wěn)定性.哌啶羰基在堿中穩(wěn)定，但是沒(méi)能很好地抑制消旋，而且脫保護(hù)時(shí)要用很強(qiáng)的親核試劉如.

對(duì)咪唑環(huán)π-N保護(hù)，可以完全抑制消旋，π-N可以用芐氧甲基(Bom)和叔丁氧甲基(Bum)保護(hù)，(Bum)可以用TFA脫除，Bom更穩(wěn)定些，需用催化氫解或強(qiáng)酸脫保護(hù)，Bum是目前很有發(fā)展前途的His側(cè)鏈保護(hù)基，其不足之處在于Fmoc(His)Bum在DCM和DMF中的溶解度較差.

7.5 Cys

Cys的－SH具有強(qiáng)親核性，易被?；闪蛎眩惨妆谎趸癁槎蜴I，必須加以保護(hù).常用保護(hù)基有三類：一類用TFA可脫除，如對(duì)甲芐基、對(duì)甲氧芐基和三苯甲基等；第二類可用(CF3CO)3T1／TFA脫除，對(duì)TFA穩(wěn)定.如t-Bu、Bom和乙酰胺甲基等.第三類對(duì)弱酸穩(wěn)定，如芐基和叔丁硫基(stBu)等，Cys(StBu)可用巰基試劑和磷試劑還原，Cys(Bzl)可用Na/NH3(1)脫保護(hù).

7.6 Arg

Arg的胍基具有強(qiáng)親核性和堿性，必須加以保護(hù).理想的情況是三個(gè)氮都加以保護(hù)，實(shí)際上保護(hù)1或2個(gè)胍基氮原子.保護(hù)基分四類：(1)硝基(2)烷氧羰基(3)磺?；?4)三苯甲基.

硝基在制備、?；呀庵挟a(chǎn)生很多副反應(yīng)，應(yīng)用不廣.烷氧羰基應(yīng)主要有Boc和二金剛烷氧羰基(Adoc)2、Fmoc(Arg)Boc的耦聯(lián)反效率不高，哌啶理時(shí)不處穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生副反應(yīng)；Adoc保護(hù)了兩個(gè)非π－N，但有同樣的副反應(yīng)發(fā)生.對(duì)磺?；Ｗo(hù)，其中TOS應(yīng)用最廣，但它較難脫除.近年來(lái)2，3，6-三甲基-4-甲氧苯橫酰基(Mtr)較受歡迎，在TFA作用下，30分鐘即可脫除，但是它們都不能完全抑制側(cè)鏈的?；l(fā)生.三苯甲基保護(hù)基可用TFA脫除.缺點(diǎn)是反應(yīng)較慢，側(cè)鏈仍有?；磻?yīng)，且其在DCM、DMF中溶解度不好.

7.7 Lys

Lys的ε-NH2必須加以保護(hù).但與α－NH2的保護(hù)方式應(yīng)不同，該保護(hù)基要到肽鏈合成后除去.ε－NH2的保護(hù)無(wú)消旋問(wèn)題，可以采用?；Ｗo(hù)基，其它常用的保護(hù)基有芐氧碳基和Boc.

7.8 Fmoc基團(tuán)的脫除

Fmoc基團(tuán)的芴環(huán)系的吸電子作用使9-H具有酸性，易被較弱堿除去，反應(yīng)條件很溫和.反應(yīng)過(guò)程可表示如下：

哌啶進(jìn)攻9-H,β消除形成二苯芴烯，很容易被二級(jí)環(huán)胺進(jìn)攻形成穩(wěn)定的加成物.Fmoc基團(tuán)對(duì)不同的堿穩(wěn)定性不同，可根據(jù)實(shí)際條件選用.

7.9 耦聯(lián)反應(yīng)

固相中的接肽反應(yīng)原理與液相中基本一致.將兩個(gè)相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及羧基被保護(hù)的氨基酸放在溶液內(nèi)，并不形成肽鍵.要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將羧基活化，其方法是將它變成混合酸酐，或者將它變?yōu)榛顫婖?、酰氯，或者用?qiáng)的失去劑(碳二亞胺)也可形成酰胺鍵，耦聯(lián)反應(yīng)可表示如下：(A：羰基活潑試劑)

碳二亞胺是常用的活化試劑，其中Dcc使用范圍最廣，其缺點(diǎn)是形成了不溶于DCM的DCH，過(guò)濾時(shí)又難于除盡.其他一些如二異丙基碳二亞胺(DCI)、甲基叔丁基碳二亞胺也用于固相合成中，它們形成的脲

溶于DCM中，經(jīng)洗滌可以除去.其他活化試劑，還有Bop(Bop－C1)、氯甲酸異丙酯、氯甲酸異丁酯、SOC12等.其中Dcc、Bop活化形成對(duì)稱酸酐、SOC12形成酰氯，其余三種形成不對(duì)稱酸酐.

7.10 對(duì)稱酸酐法

用Dcc形成對(duì)稱酸酐的方法使用較廣.其缺點(diǎn)是有些氨基酸在DCM中不易溶解，生成的Fmoc氨基酸酐溶解度更差.同時(shí)還有些副反應(yīng)，如形成二肽、消旋等.

7.11 混合酸酐法

最常用試劑是氯甲酸的異丙基酯和異丁基酯.前者得到的酸酐穩(wěn)定性好.只產(chǎn)生很少消旋，在適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)計(jì)量及溶劑條件下，耦聯(lián)反應(yīng)很快.而且，在此反應(yīng)中使用的N-甲基嗎啉和N-甲基哌啶對(duì)Fmoc基團(tuán)無(wú)影響.

7.12 酰氯法

在Boc法中不常用的酰氯，因?yàn)楸容^激烈，一些保護(hù)基如Boc不穩(wěn)定.但是，F(xiàn)moc基團(tuán)可以耐受酰氯處理，生成的Fmoc氨基酰氯也很穩(wěn)定.在三甲基乙酸／三胺或苯并三氮唑／二異丙基乙二胺中，反應(yīng)速度很快，消旋很少.酰氯法在固相合成中應(yīng)用還不多，但已表明，F(xiàn)moc－氨基酰氯適用于合成有立體障礙的肽序列.

7.13 活化酯法

活化酯法在固相合成中應(yīng)用最為廣泛.采用過(guò)的試劑也很多，近來(lái)最常用的有HOBt酯、ODhbt酯、OTDO酯等.

HOBt酯反應(yīng)快，消旋少，用碳二亞胺很容易制得；ODhbt酯很穩(wěn)定，容易進(jìn)行分離純化，與HOBt酯具有類似的反應(yīng)性和消旋性能，它還有一個(gè)優(yōu)越之處，在?；瘯r(shí)有亮黃色、耦聯(lián)結(jié)束時(shí)顏色消失，有利于監(jiān)測(cè)反應(yīng)；OTDO酯與ODhbt酯類似，消旋化極低，易分離，?；瘯r(shí)伴有顏色從桔紅色到黃色的變化等.

7.14 原位法

將碳二亞胺和α－N保護(hù)氨基酸直接加到樹(shù)脂中進(jìn)行反應(yīng)叫做原位法.

用DIC代替Dcc效果更好.其他的活化試劑還有Bop和Bop-C1等.原位法反應(yīng)快、副反應(yīng)少、易操作.其中DIC最有效，其次是Bop、Bop-C1等.遺憾的是Bop?；瘯r(shí)生成致癌的六甲基磷酰胺，限制了其應(yīng)用.

7.15 裂解及側(cè)鏈保護(hù)基脫除

Fmoc法裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基時(shí)可采用弱酸.TFA為應(yīng)用最廣泛的弱酸試劑，它可以脫除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；條件溫和、副反應(yīng)較少.不足之處：Arg側(cè)鏈的Mtr很難脫除，TFA用量較大；無(wú)法除掉Cys的t-Bu等基因.也有采用強(qiáng)酸脫保護(hù)的方法：如用HF來(lái)脫除一些對(duì)弱酸穩(wěn)定的保護(hù)基，如Asp、Glu、Ser、Thr的Bzl(芐基)保護(hù)基等，但是當(dāng)脫除Asp 的吸電子保護(hù)基時(shí)，會(huì)引起環(huán)化副反應(yīng).而TMSBr和TMSOTf在有苯甲硫醚存在時(shí)，脫保護(hù)速度很快.此外，根據(jù)條件不同，堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也有應(yīng)用.

Fmoc基團(tuán)用于固相合成多肽已經(jīng)有了十多年的歷史，在合成一些含有在酸性條件下不穩(wěn)定的氨基的殘基的肽時(shí)，具有特別優(yōu)越之處.將Fmoc法和Boc法互相補(bǔ)充，定會(huì)在合成更多、更大的生物分子中發(fā)揮．