1.多肽合成的基本原理?

多肽固相合成法是多肽合成化學(xué)的一個重大的突破。它的最大特點是不必純化中間產(chǎn)物，合成過程可以連續(xù)進(jìn)行，進(jìn)而為多肽合成的自動化奠定了基礎(chǔ)。目前全自動多肽的合成，基本都是固相合成。其基本過程如下：

基于Fmoc化學(xué)合成，先將所要合成的目標(biāo)多肽的C-端氨基酸的羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這一氨基酸的氨基作為多肽合成的起點，同其它的氨基酸已經(jīng)活化的羧基作用形成肽鍵，不斷重復(fù)這一過程，即可得到多肽。根據(jù)多肽的氨基酸組成不同，多肽后處理方式不同，純化方式也有差異。

2.多肽狀態(tài)是如何?如何保存儲存?

我們提供的多肽是粉末狀，一般為灰白色，組成不同，多肽粉末的顏色有差異，多肽一般長期保存需要避光保存，并應(yīng)保存在-20度，短期可以保存在4度?？梢远虝r間的話是以室溫運輸。

3.如何溶解多肽?

因為多肽溶解比較復(fù)雜，通常是先取一點試驗，在沒有確定合適的溶劑前請勿全部溶解。

下列為選擇溶解溶劑的一般方法：

(1)判定多肽的電荷特定，設(shè)定酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)和C端COOH為-1；堿性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)及N端NH2為+1,其它氨基酸的電荷為0。計算出凈電荷數(shù)。

(2)如果凈電荷數(shù) >0，多肽為堿性，用水溶解：如果不溶解或溶解性不大，加入醋酸(10%以上)；如果多肽還不能溶解，加入少量TFA(25ul)溶解，然后加入500ul水稀釋。

(3)如果凈電荷數(shù)<0，多肽為酸性，用水溶解；如果不溶解或溶解性不大，加入氨水(25ul)溶解，然后加入500ul水稀釋。

(4)如果凈電荷數(shù)=0，多肽為中性，一般需要用有機溶劑如乙腈，甲醇或異丙醇，DMSO等溶解。還有人建議需要尿素來溶解疏水性很大的多肽。

4.非HPLC純化的多肽和經(jīng)過HPLC純化的多肽有何區(qū)別?

粗品和脫鹽級別的多肽中雜質(zhì)為多肽和非多肽類：如非全長多肽和多肽后處理的一些原料如DTT、TFA等；而經(jīng)過HPLC純化的多肽，仍會有一些雜質(zhì)存在，其中的雜質(zhì)主要是短肽和微量TFA。

5.多長的多肽為合適?

多肽合成需要考慮多肽的長度，電荷，親疏水性等因素。長度越長，合成粗品的純度和產(chǎn)率都隨著降低，純化的難度和無法合成的幾率就會大些。當(dāng)然多肽功能區(qū)的序列是無法改變的，但是為了多肽的順利合成，有時不得不在功能區(qū)的上下游增加一些輔助氨基酸，以改善多肽的溶解性和親疏水性。如果多肽太短，合成也可能有問題，主要問題是合成的多肽在后處理過程中有一定的難度，5肽以下的多肽，一般要有疏水的氨基酸，否則后處理難度加大。15個氨基酸殘基以下的多肽一般都可以得到滿意的產(chǎn)率和得率。
6.如何從多肽序列中判定多肽的溶解性?

(1)多肽中如果含有高比例的疏水性很強的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,Phe和Trp，多肽很難溶解于水性溶液中或根本不可能溶解。這些氨基酸無論是純化或合成，都有可能有問題。

(2)一般情況下疏水性氨基酸的比例<50%，不能連續(xù)5個連續(xù)aa為疏水性，帶電荷的氨基酸的(正電荷K,R,H,N-terminus,負(fù)電荷D,E,C- terminus)的比例達(dá)到20%，在多肽的N或C短如果能增加極性氨基酸，也可以改善溶解性。

7.為什么含有Cys,Met,或Trp的多肽難合成?

含有Cys, Met,或Trp的多肽難以合成，同時難以獲得高純度的產(chǎn)品。主要因為這些基團(tuán)不穩(wěn)定，易氧化。這些多肽的使用和儲存都需要特別注意，避免反復(fù)開啟蓋子。

8.為什么有些多肽的合成產(chǎn)率或純度會比較低?

多肽合成與引子合成有比較大的區(qū)別，不能合成的引子很少，但是不能合成的多肽經(jīng)常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr這些氨基酸比鄰或重復(fù)時，多肽鏈在合成過程中不能完全舒展溶解，合成效率下降。以下幾種情形，合成效率和產(chǎn)物的純度都比較低，如：重復(fù)Pro,Ser-Ser，重復(fù)Asp，4個連續(xù)Gly等.

9.多肽是如何純化的?

多肽純化一般使用反相柱(如C8，C18等)，214nm。緩沖體系通常為含TFA的溶劑，pH 2.0 。Buffer A為含0.1%TFA in ddH2O，Buffer B為1%TFA/ACN/ pH 2.0。純化前用Buffer A溶解；如果溶解不好，用Buffer B溶解后，然后用Buffer A稀釋；對疏水性強的多肽，有時還需要加入少量的Formic Acid或醋酸。HPLC分析多肽粗產(chǎn)物，如果多肽不長(15aa以下)，一般會有主峰，主峰通常為全長產(chǎn)物；對于20aa以上的長肽，如果沒有主峰，HPLC需搭配Mass來判定分子量，進(jìn)而確定哪個峰是所要合成的多肽.

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