合成多肽藥物可視為界于有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)大分子之間的一類(lèi)特殊藥物。在《制備工藝和過(guò)程控制對(duì)合成多肽藥物有關(guān)物質(zhì)的影響》［1］中已對(duì)合成多肽藥物制備工藝部分進(jìn)行了論述，本文主要就合成多肽藥物質(zhì)控項(xiàng)目設(shè)置的合理性和雜質(zhì)譜研究的全面性進(jìn)行探討。

1、相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則

合成多肽作為一類(lèi)特殊的藥物，其氨基酸序列、潛在的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)以及制備工藝和質(zhì)控要求等，與經(jīng)典小分子化學(xué)藥物相比有明顯差異，具有多樣性和復(fù)雜性，也可能是這個(gè)原因，國(guó)內(nèi)外指導(dǎo)文件很少涉及此類(lèi)品種。FDA 于1994 年發(fā)布了“Guidance forIndustry for the Submission of Chemistry，Manufacturing，and Controls Information for Synthetic Peptide Substances”，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局( CFDA) 于2007 年發(fā)布了“合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則”，2個(gè)指導(dǎo)原則對(duì)合成多肽藥物的制備工藝、結(jié)構(gòu)確證、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定性研究等方面提出了相應(yīng)的技術(shù)要求，在當(dāng)時(shí)對(duì)多肽藥物的研究和開(kāi)發(fā)起到了積極的指導(dǎo)作用。但隨著藥品開(kāi)發(fā)、質(zhì)控理念的提升，未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則進(jìn)行相應(yīng)更新。如何結(jié)合最新藥品研發(fā)理念，合理開(kāi)發(fā)并控制多肽類(lèi)藥物的質(zhì)量具有重要意義。

2、多肽原料藥質(zhì)控概況

目前，國(guó)內(nèi)外藥典收載了十幾個(gè)合成多肽藥物，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的控制項(xiàng)目主要包括: 外觀、比旋度、鑒別、酸度、溶液澄清度與顏色、氨基酸組成、殘留溶劑( 醋酸、三氟乙酸) 、水分、有關(guān)物質(zhì)、微生物限度、含量等。美國(guó)藥典委員會(huì)多肽專(zhuān)家小組于2014 年發(fā)表了相關(guān)文章，論述了多肽藥物質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)及相應(yīng)分析方法，見(jiàn)表1。質(zhì)控項(xiàng)目中氨基酸序列、肽譜、氨基酸組成等為多肽類(lèi)藥物特有質(zhì)控項(xiàng)目，也是多肽藥物的常規(guī)檢查項(xiàng)目。與經(jīng)典小分子化藥相比，合成多肽藥物在鑒別和有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)目存在一定的特殊性。

2.1 鑒別

藥典收載的合成多肽類(lèi)原料藥鑒別項(xiàng)目多為以下方法: 高效液相色譜法( HPLC 法，色譜條件與含量測(cè)定項(xiàng)下方法相同) 、紅外法、雙縮脲顯色反應(yīng)等。對(duì)于多肽類(lèi)藥物來(lái)說(shuō)，上述鑒別項(xiàng)目專(zhuān)屬性較差，需考慮增加專(zhuān)屬性更強(qiáng)的檢測(cè)手段進(jìn)行鑒別考察，如肽譜、核磁或質(zhì)譜等鑒別方法。如現(xiàn)行版美國(guó)藥典中，收載的去氨加壓素原料藥，鑒別項(xiàng)目采用質(zhì)譜檢測(cè); 現(xiàn)行版歐洲藥典中，收載的布舍瑞林和戈舍瑞林原料藥鑒別項(xiàng)目采用核磁檢測(cè)。采用質(zhì)譜法鑒別，其結(jié)果應(yīng)在理論值的±1.0質(zhì)量單位內(nèi)。

核磁共振光譜鑒別適用于氨基酸數(shù)目較少的多肽藥物，對(duì)于超過(guò)10 個(gè)氨基酸殘基的多肽，核磁共振光譜數(shù)據(jù)分析會(huì)受到一定的挑戰(zhàn)，可以選擇使用肽譜進(jìn)行鑒別研究。美國(guó)藥典委員會(huì)多肽專(zhuān)家小組建議: 如選擇HPLC 定位方法作為鑒別方法，應(yīng)對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品主峰的保留時(shí)間進(jìn)行比較，并要求標(biāo)準(zhǔn)品和樣品等劑量混合進(jìn)樣時(shí)，能得到單峰。

2.2 有關(guān)物質(zhì)

合成多肽藥物的雜質(zhì)譜復(fù)雜，包含由起始物料引入的雜質(zhì)、工藝相關(guān)的雜質(zhì)和降解產(chǎn)生的雜質(zhì)等。為實(shí)現(xiàn)有效檢出各潛在雜質(zhì)，通常需要采用多種不同原理的檢測(cè)方法如反相HPLC 法、離子交換HPLC 法、分子排阻HPLC 法等。如某進(jìn)口39 肽藥物，原料藥中控手段采用反相HPLC 法控制13 個(gè)已知雜質(zhì)、最大未知單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì); 離子交換HPLC 法控制2 個(gè)特定雜質(zhì); 分子排阻HPLC法控制二聚體等聚合物雜質(zhì)。如經(jīng)過(guò)充分的方法學(xué)驗(yàn)證，也可以采用單一的HPLC 方法。

現(xiàn)行版歐洲藥典通則中提出的多肽原料藥雜質(zhì)限度要求比ICH Q3A 指導(dǎo)原則的要求更寬泛，報(bào)告閾值、鑒定閾值和界定閾值分別為0.1%，0.5% 和1.0%。主要依據(jù)可能是與傳統(tǒng)小分子藥物的雜質(zhì)相比，多肽類(lèi)雜質(zhì)引發(fā)毒理學(xué)問(wèn)題的風(fēng)險(xiǎn)較低。美國(guó)藥典委員會(huì)多肽專(zhuān)家小組對(duì)多肽藥物的雜質(zhì)限度存在其他要求，認(rèn)為不同的多肽藥物的活性存在較大差異，不同的雜質(zhì)可能同樣存在活性的差別，同時(shí)多肽類(lèi)藥物多為注射劑，風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高。因此，該小組認(rèn)為多肽藥物雜質(zhì)限度的制定應(yīng)該結(jié)合特定品種進(jìn)行具體分析。

3、雜質(zhì)譜研究

如《制備工藝和過(guò)程控制對(duì)合成多肽藥物有關(guān)物質(zhì)的影響》所述，多肽藥物雜質(zhì)譜復(fù)雜，應(yīng)結(jié)合起始物料情況、制備工藝和穩(wěn)定性考察結(jié)果對(duì)多肽藥物進(jìn)行系統(tǒng)的雜質(zhì)譜分析。目前，國(guó)內(nèi)申請(qǐng)人向CFDA 遞交的合成多肽藥物雜質(zhì)譜研究資料要么不夠充分，考察雜質(zhì)較少，未對(duì)由起始物料引入的雜質(zhì)、工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)等進(jìn)行系統(tǒng)的考察; 要么考察數(shù)十個(gè)雜質(zhì)，堆積“龐大”的雜質(zhì)譜研究資料，將合成、降解引入的雜質(zhì)與其他雜質(zhì)混為一體，缺乏針對(duì)性分析和研究。以某28 肽藥物為例，共考察了65 個(gè)潛在雜質(zhì)，所研究的雜質(zhì)譜中有23 個(gè)缺失10 ～ 16 個(gè)氨基酸殘基的缺失肽雜質(zhì)，暫且不考慮上述雜質(zhì)在氨基酸偶聯(lián)過(guò)程中生成的可能性，該產(chǎn)品制備工藝最后精制過(guò)程中有柱層析提純步驟，缺失氨基酸數(shù)目較多的缺失肽雜質(zhì)性質(zhì)與目標(biāo)多肽性質(zhì)相差較大，即使在氨基酸偶聯(lián)過(guò)程中能產(chǎn)生上述雜質(zhì)，在柱層析過(guò)程中也能有效除去，引入終產(chǎn)品的可能性很小，提供的終產(chǎn)品檢測(cè)報(bào)告中證明上述雜質(zhì)在終產(chǎn)品中均不存在。另外，本品雜質(zhì)譜研究中，對(duì)潛在易水解和易消旋的氨基酸引入的雜質(zhì)均未進(jìn)行針對(duì)性研究，因此盡管考察雜質(zhì)數(shù)量很多，雜質(zhì)譜研究仍存在較大缺陷。綜上，結(jié)合對(duì)氨基酸的性質(zhì)、整個(gè)制備過(guò)程和潛在的降解途徑的理解，對(duì)合成多肽的雜質(zhì)譜研究尤為重要。

美國(guó)藥典委員會(huì)多肽專(zhuān)家小組發(fā)表的文章中，涉及了合成多肽藥物雜質(zhì)譜研究?jī)?nèi)容和考察方法，見(jiàn)表2 和表3?！吨苽涔に嚭瓦^(guò)程控制對(duì)合成多肽藥物有關(guān)物質(zhì)的影響》一文中也對(duì)可能由起始物料和制備過(guò)程中引入的缺失肽、錯(cuò)結(jié)肽等雜質(zhì)進(jìn)行了討論。本文主要針對(duì)差向肽雜質(zhì)、鏈端雜質(zhì)、側(cè)鏈雜質(zhì)、氧化雜質(zhì)等進(jìn)行討論。

3.1 差向肽雜質(zhì)

差向肽雜質(zhì)為氨基酸序列中含1 個(gè)或多個(gè)非預(yù)期手性構(gòu)型的氨基酸殘基所形成的肽鏈，差向肽雜質(zhì)可能形成于原料氨基酸中的光學(xué)異構(gòu)體，因此需要對(duì)該類(lèi)原料進(jìn)行嚴(yán)格控制; 也可能形成于肽鏈合成過(guò)程中差向異構(gòu)化。目前已知的差向異構(gòu)化機(jī)理包括: 直接烯醇化和生成惡唑酮( 氮雜內(nèi)酯) 。其機(jī)制見(jiàn)圖1。在Fmoc 保護(hù)策略的固相合成工藝中，由于避免了活化肽鏈端羧基，差向肽主要形成機(jī)理為氨基酸偶聯(lián)過(guò)程中直接烯醇化，在氨基酸偶聯(lián)過(guò)程中所使用的催化劑等堿性試劑具有催化脫氫作用，形成碳負(fù)離子，而部分氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)具有穩(wěn)定該碳負(fù)離子的作用，因此在偶聯(lián)過(guò)程中易產(chǎn)生

相應(yīng)的差向肽雜質(zhì)，如半胱氨酸( Cys) 、組氨酸( His) 。

相對(duì)于其他類(lèi)型雜質(zhì)來(lái)說(shuō)，差向肽雜質(zhì)鑒定和分離均有較大難度。尤其對(duì)于含有氨基酸數(shù)目較多的多肽藥物，對(duì)每個(gè)手性氨基酸均利用合成相應(yīng)的差向肽雜質(zhì)對(duì)照品，使用HPLC 出峰時(shí)間對(duì)比鑒定的方法工作量巨大?？刹捎寐然跠Cl］/氘代水［D2O］水解衍生后，采用手性氣相色譜-質(zhì)譜( GCMS)來(lái)測(cè)定每個(gè)氨基酸手性異構(gòu)體的含量，鑒別出易產(chǎn)生消旋的氨基酸，進(jìn)一步制備出相應(yīng)的差向肽雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行HPLC 出峰時(shí)間對(duì)比鑒定，證明擬定分析方法可以有效檢出易產(chǎn)生的差向肽雜質(zhì)。

3.2 鏈末端雜質(zhì)

鏈末端雜質(zhì)包括兩大類(lèi): 一類(lèi)是N 端?；駽 端脫酰胺化產(chǎn)生的雜質(zhì)。該類(lèi)雜質(zhì)在合成或制備過(guò)程中較易得到雜質(zhì)對(duì)照品，研究難度不大。另一類(lèi)雜質(zhì)是由鏈末端活性基團(tuán)“反咬”所形成的雜質(zhì)，如N 端的氮原子對(duì)第2 個(gè)與第3 個(gè)氨基酸殘基之間酰胺鍵中的羰基發(fā)生親核進(jìn)攻，隨后導(dǎo)致上述2 個(gè)氨基酸殘基發(fā)生截?cái)?，生成二酮哌嗪?lèi)物質(zhì)，肽鏈生成少2 個(gè)氨基酸的缺失肽雜質(zhì)。當(dāng)N 端為位阻較小的脯氨酸，甘氨酸殘基時(shí)，有利于上述副反應(yīng)的發(fā)生。另一方面，如N 端氨基酸殘基為谷氨酰胺時(shí)，則焦谷氨酸生成反應(yīng)可能性很大。與上述反應(yīng)機(jī)制類(lèi)似，即N 端氮原子進(jìn)攻谷氨酰胺側(cè)鏈羰基碳后生成焦谷氨酸多肽類(lèi)似物。N 端殘基為天冬酰胺時(shí)也可發(fā)生這一轉(zhuǎn)化過(guò)程。二酮哌嗪和焦谷氨酸降解機(jī)制見(jiàn)圖2。

3.3 側(cè)鏈雜質(zhì)

側(cè)鏈雜質(zhì)主要可分為2 類(lèi): 側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)引入的雜質(zhì)和氨基酸側(cè)鏈本身具有反應(yīng)活性引入的雜質(zhì)。在多肽合成過(guò)程中，側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)在酸解脫除過(guò)程中，可能存在脫除不完全，同時(shí)形成的碳正離子可能與肽鏈中潛在的親核位點(diǎn)偶聯(lián)，形成其他雜質(zhì)。此類(lèi)雜質(zhì)一般會(huì)表現(xiàn)出與目標(biāo)多肽分子量、極性等方面的差異，因此采用適當(dāng)?shù)氖侄慰梢猿浞终f(shuō)明。

由氨基酸側(cè)鏈本身的反應(yīng)活性引入雜質(zhì)的分析則需建立在對(duì)所組成氨基酸性質(zhì)充分理解的基礎(chǔ)上，較常見(jiàn)的是由谷氨酰胺、天冬酰胺側(cè)鏈酰胺鍵水解產(chǎn)生的降解雜質(zhì)。上述氨基酸可以進(jìn)一步發(fā)生如下副反應(yīng)，由天冬酰胺水解產(chǎn)生的天冬氨酸，或多肽序列中含有的天冬氨酸，則易生成琥珀酰亞胺結(jié)構(gòu)，通過(guò)C 端酰胺基氮原子對(duì)天冬酰胺或天冬氨酸殘基的γ-羰基發(fā)生親核進(jìn)攻，形成五元琥珀酰亞胺環(huán)的反應(yīng)。弱酸性條件有利于上述成環(huán)反應(yīng)，生成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)在生理?xiàng)l件和堿性條件下均不穩(wěn)定，可發(fā)生消旋化。琥珀酰亞胺環(huán)的消旋化和水解可生成由L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-異天冬氨酸和D-異天冬氨酸組成的混合物，因此可使原天冬酰胺殘基發(fā)生脫酰胺基化和消旋化，或可使原天冬氨酸殘基發(fā)生異構(gòu)化和消旋化生成系列雜質(zhì)。如肽鏈中含有谷氨酰胺或谷氨酸時(shí)，也可發(fā)生類(lèi)似的副反應(yīng)。琥珀酰亞胺降解機(jī)制見(jiàn)圖3。

精氨酸側(cè)鏈可以發(fā)生氨基化，反應(yīng)生成一級(jí)胺，轉(zhuǎn)化為鳥(niǎo)氨酸殘基的副反應(yīng)。該鳥(niǎo)氨酸殘基含1 個(gè)未受保護(hù)的氨基，因此可與其他氨基酸殘基發(fā)生偶聯(lián)，進(jìn)一步生成其他雜質(zhì)。

半胱氨酸中碳硫鍵在氫氧根離子催化下可發(fā)生β-消除的副反應(yīng)，該副反應(yīng)將生成2 種新殘基( 即脫氫丙氨酸殘基和硫代半胱氨酸殘基) 。脫氫丙氨酸可與合成體系中含有的賴(lài)氨酸或其他含有活性氨基化合物反應(yīng)，發(fā)生賴(lài)氨酸-丙氨酸交聯(lián)，生成聚集體雜質(zhì)，硫代半胱氨酸則可進(jìn)一步降解為含巰基的產(chǎn)物，相關(guān)降解途徑見(jiàn)圖4。絲氨酸和蘇氨酸殘基也可能發(fā)生β-消除副反應(yīng)。

酸殘基可能發(fā)生氧化或還原反應(yīng)。已在卡貝縮宮素和依來(lái)多辛中分別發(fā)現(xiàn)了因半胱氨酸和甲硫氨酸殘基氧化而形成的雜質(zhì)。上述雜質(zhì)相對(duì)于目標(biāo)序列多肽的質(zhì)量差異為16，32 和48 Da，為不同氧化階段產(chǎn)生的雜質(zhì)，即亞砜、砜和磺酸。組氨酸和賴(lài)氨酸也易發(fā)生氧化，分別生成2-氧代-組氨酸和氨基己二酸，貯存過(guò)程中長(zhǎng)時(shí)間光照或暴露在空氣中均可導(dǎo)致生成氧化雜質(zhì)。此外，色氨酸側(cè)鏈在酸性條件下的反應(yīng)活性較高，可發(fā)生氧化生成系列雜質(zhì)，還可發(fā)生還原反應(yīng)。易發(fā)生氧化和還原的氨基酸殘基的總結(jié)情況見(jiàn)圖5。

3.5 多聚體雜質(zhì)

多肽藥物在純化和放置過(guò)程中，由于端基具有反應(yīng)活性或二硫鍵的改變等，可能生成一定量的多聚體雜質(zhì)。如去氨加壓素中，發(fā)現(xiàn)并鑒定出的多聚體雜質(zhì)有6 種之多。多聚體雜質(zhì)一般可使用分子排阻色譜法進(jìn)行有效的檢測(cè)。

4、小結(jié)

合成多肽藥物的開(kāi)發(fā)需要建立在對(duì)多肽藥物充分理解的基礎(chǔ)上，建立全面的質(zhì)控策略。雜質(zhì)譜研究應(yīng)對(duì)起始物料引入的雜質(zhì)、制備工藝中生成的雜質(zhì)、降解過(guò)程產(chǎn)生的雜質(zhì)進(jìn)行充分考察，保證雜質(zhì)譜研究的全面性。