分析方法轉(zhuǎn)移是制藥行業(yè)中常見的技術(shù)轉(zhuǎn)移，常見的情形有在分析研發(fā)實(shí)驗(yàn)室間的轉(zhuǎn)移；研發(fā)實(shí)驗(yàn)室與QC實(shí)驗(yàn)室間的轉(zhuǎn)移；樣品生產(chǎn)地點(diǎn)變更時(shí)，QC實(shí)驗(yàn)室間的轉(zhuǎn)移。藥物研發(fā)早期，對(duì)分析方法轉(zhuǎn)移的法規(guī)要求不高；在研發(fā)后期或者商業(yè)化階段，方法在QC實(shí)驗(yàn)室之間的轉(zhuǎn)移，對(duì)定性與定量結(jié)果的一致性有較高要求。任何結(jié)果的偏離要非常小心，否則易產(chǎn)生超限或超趨（OOX）的結(jié)果。方法轉(zhuǎn)移前，如果方法驗(yàn)證與耐用性的研究比較充分，對(duì)方法的認(rèn)知比較了解，方法轉(zhuǎn)移時(shí)出現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果偏移時(shí)會(huì)能有足夠的信息與手段來應(yīng)對(duì)與解決。

方法轉(zhuǎn)移考察的參數(shù)早期通常有精密度與系統(tǒng)適用性數(shù)據(jù)對(duì)比；后期通常會(huì)有精密度、準(zhǔn)確度和系統(tǒng)適用性等數(shù)據(jù)對(duì)比。精密度和準(zhǔn)確度的數(shù)據(jù)測(cè)試，與方法條件與參數(shù)設(shè)置相關(guān)，也與不同實(shí)驗(yàn)室儀器系統(tǒng)密切相關(guān)。

本文試著從色譜方法自身、色譜儀器系統(tǒng)部分和儀器系統(tǒng)差異性等內(nèi)容討論方法轉(zhuǎn)移的一些常見色譜儀系統(tǒng)的考量與挑戰(zhàn)。

1. 分析方法條件

一個(gè)有效成功的分析方法轉(zhuǎn)移，首先是方法自身處于可控狀態(tài)，方法有可控的條件與參數(shù)，包括一些操作注意事項(xiàng)。表1是液相色譜方法常見的條件與參數(shù)：

表1液相色譜方法常見條件

方法轉(zhuǎn)移要考慮的元素有方法程序、樣品配制、化學(xué)試劑、樣品配制、其它的設(shè)備附件、色譜柱、流動(dòng)相，以及色譜儀系統(tǒng)。分析方法操作人員也是一個(gè)關(guān)鍵元素，因?yàn)榉椒ǖ闹R(shí)交流與傳遞非常重要。一個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的分析人員，對(duì)于方法有相當(dāng)?shù)牧私?，哪些地方需要特別注意，哪些地方是方法運(yùn)行的關(guān)鍵。在與接收方實(shí)驗(yàn)人員交流與培訓(xùn)時(shí)，這些經(jīng)驗(yàn)知識(shí)非常重要。方法文件的撰寫需要有經(jīng)驗(yàn)的分析人員參與，每一個(gè)關(guān)鍵操作步驟都有詳盡的描述，否則轉(zhuǎn)移后樣品配制的操作方式不同，都有可能導(dǎo)致系統(tǒng)適用性結(jié)果不同。樣品配制用的化學(xué)試劑盡量用同一純度或同一廠家。樣品配制設(shè)備，如pH計(jì)、吸液槍/管、天平等，需要有實(shí)驗(yàn)室可靠的校驗(yàn)方可使用。 

進(jìn)行方法轉(zhuǎn)移時(shí)需要根據(jù)藥物的研發(fā)階段和方法的需求進(jìn)行適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，如圖1。色譜儀系統(tǒng)、流動(dòng)相、樣品處理和色譜柱是影響方法使用和轉(zhuǎn)移的主要因素。

色譜柱是實(shí)驗(yàn)室間方法轉(zhuǎn)移差異性的關(guān)鍵原因。色譜柱是分析方法的核心元素，它直接影響到系統(tǒng)適用性結(jié)果。方法轉(zhuǎn)移如能嚴(yán)格要求采用同一廠家同一型號(hào)的色譜柱，可以很大程度減少色譜柱對(duì)于方法的影響。常用的C18?C8等硅烷色譜柱，大廠家大品牌的技術(shù)很成熟，批次與批次間的差異性很小。同一廠家同一型號(hào)的新老色譜柱由于使用時(shí)間不同，柱效會(huì)有差異，這是不同實(shí)驗(yàn)室間柱效不同的主要原因，因此方法轉(zhuǎn)移時(shí)盡量使用新的色譜柱，減少柱效對(duì)方法的影響。在方法轉(zhuǎn)移前，如有色譜柱耐用性的研究考察，將減少方法轉(zhuǎn)移的技術(shù)困難。

流動(dòng)相的制備也是方法轉(zhuǎn)移差異性的主要原因。流動(dòng)相組成包括水、有機(jī)溶劑、緩沖鹽或酸堿添加劑。水與有機(jī)溶劑的化學(xué)純度影響色譜圖的基線波動(dòng)與噪音，緩沖鹽與酸堿添加劑的化學(xué)純度是色譜圖中出現(xiàn)鬼峰的主要因素。流動(dòng)相的新鮮制備、pH值的穩(wěn)定性和微生物的濾除會(huì)減少色譜圖中雜質(zhì)峰的出現(xiàn)，從而確保前后色譜圖的一致性。

流動(dòng)相的不同制備方式會(huì)導(dǎo)致方法的差異性。比如制備一個(gè)50/50的甲醇/水的混合溶劑有四種方式：①先加入500ml的水至1000ml的容量瓶中，用甲醇稀釋至1000ml;②先加入500ml的甲醇至1000ml的容量瓶中，用水稀釋至1000ml;③分別使用量筒量取500ml的水與甲醇混合；④分別稱量500g的水與甲醇混合。由于水與甲醇混合時(shí)會(huì)有放熱的情況，水與甲醇的密度不同，因此這四種方式制備得到的混合溶劑實(shí)際組成是有一些差別的。這種差別會(huì)導(dǎo)致它作為洗脫劑時(shí)洗脫能力不同，從而導(dǎo)致色譜峰的保留差異。

因此在方法文件中要盡可能描述清楚流動(dòng)相的配制過程、樣品的配制過程和系統(tǒng)適用性溶液的配制過程。雙方實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照方法程序的要求進(jìn)行操作，會(huì)減少由于操作本身而導(dǎo)致的差異。

流動(dòng)相的配制過程客觀上會(huì)存在一些差異，因此在方法程序上可以設(shè)計(jì)成色譜系統(tǒng)的多項(xiàng)混合洗脫，使用泵系統(tǒng)進(jìn)行流動(dòng)相混合，減少人工配制導(dǎo)致的比例差異。

不同實(shí)驗(yàn)室的色譜儀系統(tǒng)客觀上會(huì)存在一些差異，在方法轉(zhuǎn)移前如能有方法耐用性的研究數(shù)據(jù)支持，或者參考USP<621>通則，適當(dāng)調(diào)整方法參數(shù)，減少這些差別和滿足方法系統(tǒng)適用性的要求。

2. 色譜儀系統(tǒng)的差別

色譜儀系統(tǒng)是方法轉(zhuǎn)移的重要影響因素，也是導(dǎo)致方法不一致的主要原因。色譜儀是由多個(gè)模塊組成，不同模塊有不同型號(hào)，實(shí)驗(yàn)室間的色譜儀器客觀上很難保持完全一致，這種差異會(huì)導(dǎo)致方法轉(zhuǎn)移后的差別。方法的使用壽命有時(shí)也長(zhǎng)于色譜系統(tǒng)，儀器的更新速度也會(huì)增加方法一致性的難度。

色譜系統(tǒng)液體流動(dòng)路徑會(huì)影響化合物的保留。這個(gè)路徑包括系統(tǒng)管線、進(jìn)樣器和流動(dòng)相混合器。管線按內(nèi)徑分有0.030’’、 0.020’’、 0.010’’、 0.007’’、 0.005’’、 0.0025’’等類型，一般來說，管線內(nèi)徑的大小對(duì)系統(tǒng)的體積影響不大，但內(nèi)徑不同的管線耐壓能力不同，壓力與流速相關(guān)。所以方法的流速與系統(tǒng)的最大耐壓會(huì)決定選擇哪種管線。進(jìn)樣體積會(huì)影響峰形與分離度。極端的進(jìn)樣體積，如50uL，峰形會(huì)變寬、對(duì)稱性變差，這是因?yàn)闃悠吩诠苈分行暮捅谔幍膶恿魉俣炔煌?，從而?dǎo)致化合物被擴(kuò)散。

色譜的泵系統(tǒng)或者溶劑傳遞系統(tǒng)是方法運(yùn)行的關(guān)鍵因素。常見的有低壓四元混合單泵和高壓二元混合雙泵。等度方法相對(duì)簡(jiǎn)單，受泵的影響較小。梯度方法較為復(fù)雜，流動(dòng)相在系統(tǒng)中的比例受到泵工作原理的直接影響。低壓混合系統(tǒng)中流動(dòng)相各種組分在到達(dá)泵之前就混合完成；高壓混合系統(tǒng)中每種溶劑通過專門的泵輸送至混合器中，流動(dòng)相各溶劑比例通過各泵的相對(duì)流速來控制。同品牌色譜儀同型號(hào)的泵在不同實(shí)驗(yàn)室間基本可以做到重復(fù)；不同品牌色譜儀，泵的型號(hào)不同，對(duì)于梯度方法轉(zhuǎn)移會(huì)帶來挑戰(zhàn)。

色譜儀延遲體積的大小會(huì)影響色譜峰保留。延遲體積是從流動(dòng)相混合器到柱前入口處的流路體積。延遲體積一般在供應(yīng)商提供的資料中可以查到，也可以通過實(shí)驗(yàn)測(cè)試得到，即用兩通代替色譜柱，使用有吸收的物質(zhì)，設(shè)定梯度條件，觀察到的梯度中點(diǎn)與設(shè)置的程序梯度中點(diǎn)，兩間的差值為梯度延遲時(shí)間，乘以流速即為系統(tǒng)的延遲體積。如圖2.

延遲體積受流路內(nèi)徑的影響較小，主要受到色譜儀混合器體積的影響?；旌掀鞔嬖诓煌w積大小的產(chǎn)品，體積大，梯度的延遲效應(yīng)明顯，復(fù)雜的樣品分離會(huì)影響較大。

混合器體積會(huì)影響系統(tǒng)和色譜柱的平衡時(shí)間，還有方法回到初始梯度的時(shí)間。這些影響在進(jìn)行方法轉(zhuǎn)移時(shí)，實(shí)驗(yàn)分析人員需要考慮。

前面提到泵的工作原理，有低壓與高壓混合兩種。在運(yùn)行梯度方法時(shí)，它們的原理是不同的。低壓混合模式是各溶劑通過比例閥和在線混合器，溶劑按比例混合，然后通過單泵的高壓傳輸?shù)较到y(tǒng)。高壓混合模式是流動(dòng)相通過各自的高壓泵，按流速來控制比例，然后在線混合輸出到管路中。在低壓混合系統(tǒng)中，柱活塞與泵頭之間有一定的空間，使得混合溶劑無法全體積輸出至管路中，這部分液體將會(huì)對(duì)系統(tǒng)體積的大小產(chǎn)生影響，從而增加梯度的延遲時(shí)間。

3. 如何保持不同實(shí)驗(yàn)室的色譜儀系統(tǒng)一致性？

方法轉(zhuǎn)移的目標(biāo)是要在雙方實(shí)驗(yàn)室得到等效的分析結(jié)果。如前所述，如果不同實(shí)驗(yàn)室色譜儀系統(tǒng)是相同的，理論上結(jié)果應(yīng)是一致的?？陀^上不同實(shí)驗(yàn)室間的設(shè)備會(huì)存在差異，比如色譜儀廠家、泵的類型、管線大小、進(jìn)樣器、柱溫箱和檢測(cè)器等，還有分析人員的經(jīng)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，都可能存在差異性，從而影響方法轉(zhuǎn)移的等效性結(jié)果。

色譜儀溶劑遞送系統(tǒng)是關(guān)鍵的影響因素，它影響著系統(tǒng)的延遲體積，最終會(huì)影響梯度保留時(shí)間。對(duì)于這種影響，有三種解決方式。

一是接收實(shí)驗(yàn)室的梯度程序與初始系統(tǒng)的梯度程序準(zhǔn)確地進(jìn)行調(diào)整，使得各峰的保留時(shí)間保持一致。這種方式在實(shí)際操作中比較復(fù)雜的，依賴于方法本身和分析物的復(fù)雜性。也可參考USP<621>通則中的相關(guān)指南進(jìn)行操作，但實(shí)施起來仍有困難。

二是通過物理性的增加或減少系統(tǒng)延遲體積，以匹配初始系統(tǒng)的延遲體積，如圖3。這種方式的本質(zhì)是增加或減少混合器的體積或數(shù)量，從而調(diào)整系統(tǒng)的體積。該方式比較容易操作與實(shí)現(xiàn)。

圖3: 改變混合器，調(diào)整系統(tǒng)延遲體積

三是調(diào)整進(jìn)樣的時(shí)間程序，從而調(diào)整方法梯度開始時(shí)間。通過在進(jìn)樣程序中設(shè)置進(jìn)樣的時(shí)間，從而達(dá)到梯度開始后，進(jìn)樣仍然可以延緩一段時(shí)間后開始，該操作類同于增加了一部分系統(tǒng)體積，從而增加了保留時(shí)間。如圖4, 它是整體增加或減少系統(tǒng)的體積，所以相當(dāng)于整個(gè)延遲或加速方法梯度的間隔。

圖4: 調(diào)整梯度開始時(shí)間以匹配系統(tǒng)延遲體積

進(jìn)樣系統(tǒng)在當(dāng)前分析實(shí)驗(yàn)室中基本實(shí)現(xiàn)了全部自動(dòng)化。即由計(jì)算機(jī)程序控制，不同實(shí)驗(yàn)室間的差異很小。不同品牌供應(yīng)商的進(jìn)樣原理可能不同，大部分是定量環(huán)加六通閥，加上洗針程序基本可以消除樣品殘留的影響，所以不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)樣系統(tǒng)對(duì)方法的轉(zhuǎn)移影響較小。

柱溫對(duì)于分析方法是一個(gè)重要參數(shù)，柱溫的控制對(duì)方法轉(zhuǎn)移非常重要，它影響色譜峰保留與選擇性。通常同品牌的柱溫控制箱原理是一樣的，不同品牌的柱溫控制箱會(huì)存在差異，它們都有各自的zhuanli保護(hù)。柱溫控制箱主要包括溫度傳感器、加熱元件、隔熱材料、漏液檢測(cè)、空氣循環(huán)、進(jìn)風(fēng)和出風(fēng)系統(tǒng)、溶劑預(yù)熱等組件。這些組成部分，溶劑預(yù)熱會(huì)影響色譜峰的保留與選擇性，如圖5。因此不同品牌的色譜儀，要關(guān)注柱溫箱的控制設(shè)置，盡量保持一致的參數(shù)設(shè)置，減少柱溫對(duì)方法的影響。

圖5: 方法轉(zhuǎn)移時(shí)的流動(dòng)相預(yù)熱

檢測(cè)器也是影響方法轉(zhuǎn)移的一個(gè)因素，商品化常用的紫外檢測(cè)器有單波長(zhǎng)的UV或者全波和的PDA檢測(cè)器。方法轉(zhuǎn)移時(shí)檢測(cè)器帶寬或分辨率設(shè)置盡量保持一致，時(shí)間常量或?yàn)V波器保持一致。不同品牌檢測(cè)器的流通池會(huì)不一樣，流通池的體積會(huì)影響色譜峰峰寬，從而影響色譜峰峰高。選擇同體積的流動(dòng)池，會(huì)減小對(duì)色譜峰的影響。

小結(jié)

本文主要以色譜方法為例，討論了方法轉(zhuǎn)移時(shí)需要關(guān)注的一些情況。方法與化合物的自身復(fù)雜性特點(diǎn)會(huì)影響方法轉(zhuǎn)移的難度，同時(shí)討論了色譜儀硬件系統(tǒng)在方法轉(zhuǎn)移時(shí)的影響以及常見的解決方式。

（作者簡(jiǎn)介：曾文亮，從事新藥質(zhì)量控制和分析研發(fā)工作，個(gè)人公眾號(hào)：文亮頻道）

參考文獻(xiàn)：

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3. InstrumentConsiderations in the Transfer of Chromatographic Methods, Part III: AligningPerformance of Modules，LCGC NorthAmerica, 2019, Volume 37, Issue 3, P185–191